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介绍PCR仪的两种定量方法
来源:技术文章    发布时间:2022-11-11    浏览:500次
   将荧光基团加入到PCR反应体系中,通过不断累积荧光信号从而使对PCR全程的实时监测实现,再根据标准曲线定量分析未知模板的方法,即是荧光定量PCR技术。在实时荧光定量PCR中,实时检测全程PCR扩增过程,按照反应时间和荧光信号的变化能够将一条曲线绘制成。
  定量方法
  在实时荧光PCR中,模板的定量包括相对定量和定量2种方法。相对定量是指在一定样品中靶序列相对于另一参照序列的量的变化。定量通常根据已知的标准曲线来使我们所感兴趣基因的拷贝数确定。
  1.相对定量法
  相对定量法又分为比较Ct值的相对定量法和比较标准曲线的相对定量法两种方法。
  (1)比较Ct值的相对定量法
  该方法是同时扩增待测靶基因片段和内参照基因片段,扩增反应既能够在两个反应管中也能够在一个反应管中进行,并且通过两者的ct值的差来测量。在采用此方法过程中,相对量的计算需要用到数学公式。靶基因和内源控制物的扩增效率大体上相同是该方法的前提。因此应用过程中效率的偏移会或多或少影响实际拷贝数的估计。所以,反应体系的优化的加强是目的基因和内参基因的扩增效率相等的保障。
  (2)比较标准曲线的相对定量法
  相对定量法指的是在一定样本中,靶序列相对于另一参照样本量变化情况进行分析的方法,在使用该方法过程中,参照物必须准备,因此定量标准曲线的绘制比较容易,只要确定了标准品稀释度就能够进行对比分析。
  2.定量
  定量是通过已知的标准曲线推算出未知样本的量的方法。该方法,需要对标准样品的浓度情况进行明确,再将标准样品稀释。分为几个不同梯度浓度然后进行反应测试。纵坐标为测得的Ct值,横坐标为标准品拷贝数的对数值,从而将标准曲线绘制出来,基于标准曲线,在对未知样品定量分析的过程中样起始拷贝数能够通过ct值被推算出来。
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